第二篇 NgAgo 论文出现,没重复出韩春雨的结果,但发现其可能具有 knockdown 功能

上传 / 管理员 ·2016-12-16 生物学,分子生物学,NgAgo,韩春雨

论文标题 / NgAgo-based fabp11a gene knockdown causes eye developmental defects in zebrafish 的 Letter to the editor

作者 / Jialing Qi, Zhangji Dong, Yunwei Shi, Xin Wang, Yinyin Qin, Yongming Wang and Dong Liu

期刊 / Cell Research

发表时间 / 2016-11-11

数字识别码 / 10.1038/cr.2016.134

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11月11日,Nature 旗下生命科学期刊 Cell Reseach 在线刊登了中国南通大学神经再生重点实验室副教授刘东团队关于 NgAgo 研究的最新成果——他们发现 NgAgo 系统确实有效!在这篇题为 NgAgo-based fabp11a gene knockdown causes eye developmental defects in zebrafish 的 Letter to the editor 中,研究者观察到,NgAgo 确实可以改变斑马鱼的表型,但这并非是通过基因编辑实现的。事实上,团队通过实验得出结论,NgAgo 系统可以在不改变目标基因序列的情况下,对基因表达实现 knockdown(即下调其目标 mRNA 表达水平),且这可能与 NgAgo 的基因剪切活性没有关系。

文章作者同时强调,他们没有在斑马鱼中观察到 NgAgo 系统的基因编辑功能。

所以,曾经的“基因编辑工具”

真正作用是 knockdown ?!

我们这里先简单介绍一下以上的几个结论是怎么做出来的(您可以点击阅读原文跳转到论文原文。这篇文章是 open 的)。

首先,NgAgo 可以改变斑马鱼的表型,但与基因编辑无关

研究者选择了斑马鱼中一个名叫 fabp11a 的基因作为 NgAgo 的“调控”对象。这个基因可以编码一种脂肪酸结合蛋白,可以调节葡萄糖及脂质的稳态,还有炎症反应。除了试试 NgAgo,研究者还想看看 fabp11a 在斑马鱼胚胎发育过程的作用,于是,他们将编码 NgAgo 的 mRNA 和设计好的 5’-磷酸化单链 DNA 一起注射到了单细胞时期的斑马鱼胚胎中。

为了确保注射的 NgAgo mRNA 能够进入细胞核表达 NgAgo 蛋白,研究者专门在 mRNA 的两端增加了细胞核的定位序列(NLS);而 5’-磷酸化单链 DNA 专门靶向 fabp11a 的第二和第三个外显子——如果 NgAgo 能编辑基因,这两段基因序列将会被改变。

实验结果是:NgAgo 的存在,使 30% 的斑马鱼胚胎在发育后出现了眼部畸形,但这不是基因编辑的结果(*3)!

测序发现,fabp11a 的基因没有发生任何变化,反倒是 fabp11a mRNA 的相对表达量下降了约50%。

fabp11a 没有被编辑,但被 knockdown 了。

其次,NgAgo 的 knockdown 作用在斑马鱼中存在普遍性。

NgAgo 对 fabp11a mRNA 表达的下调是一个意外吗?为了验证这一点,研究人员又对斑马鱼中的其他四个基因进行的测试,结果发现,在靶向 ta、kdrl、 lama1 和 flt1 这4个基因时,NgAgo 都能实现 knockdown 作用,并且改变基因所对应的表型。

NgAgo 的 knockdown 作用是具有普遍性的。

最后,作者没有在 NgAgo 中重复出基因编辑功能

河北科技大学教授韩春雨此前在《自然-生物技术》上发表的文章显示,NgAgo 系统可以在 37°C 的条件下对人细胞进行基因编辑,编辑效率为 11.2%-41.3%。研究者在确保半数以上的实验斑马鱼胚胎能正常发育的条件下,将实验温度设定为 37°C。然而结果显示,NgAgo 系统在这一条件下仍没有表现出任何基因编辑活性——尽管 knockdown 效应仍然存在。

有趣的是,当研究者将 NgAgo 中两个天冬氨酸位点进行突变 —— 有研究预测,这两个位点与 NgAgo 的基因剪切催化活性有关,并没有对实验中出现的 knockdown 效应产生影响。 这说明,研究者观察到的 knockdown 效应可能与NgAgo 的基因剪切活性没有关系。

最后,研究者以这样一句话结束了本篇文章:

 

……we hypothesize that gDNA/NgAgo may bind to a target gene to block its transcription. Overall, we suggest that the gDNA/NgAgo system provides an alternative strategy for gene knockdown in zebrafish.

我们提出一种假设,即 gDNA/NgAgo 的作用可能是结合目标基因,从而阻碍基因的转录。总的说来,我们认为 gDNA/NgAgo 为斑马鱼中的基因knockdown 提供了一种替代方案。

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